數字PCR被稱(chēng)為“第三代PCR技術(shù)”，其最大的特色是將單個(gè)核酸分子分配到獨立的反應室，經(jīng)過(guò)PCR擴增反應和熒光信號檢測，實(shí)現單分子定量。數字PCR技術(shù)不依賴(lài)Ct值和標準曲線(xiàn)，同時(shí)具有極高的靈敏度、準確度和極佳的重復性，是超越實(shí)時(shí)熒光PCR的一種絕對定量分析技術(shù)。

數字PCR技術(shù)與生俱來(lái)的優(yōu)勢：1）能夠檢測稀少的珍貴樣本；2）能夠檢測成分復雜的樣本；3）能夠減少PCR抑制劑的影響。這些優(yōu)勢拓寬了數字PCR在體外診斷領(lǐng)域的應用。

1. SNV檢測
單核苷酸位點(diǎn)變異（SNV），包括常見(jiàn)的點(diǎn)替換、插入或缺失。腫瘤精準醫學(xué)的伴隨診斷中，常?？梢詸z測到腫瘤驅動(dòng)基因的點(diǎn)變異，如TP53 R175H，EGFR L858R，KRAS G12V，NRAS Q61R，BRAF V600E等。二代測序技術(shù)的靈敏度可達到1%，在檢測的數據量上優(yōu)勢很大，但在檢測一些背景信號很高或變異頻率很低的樣本時(shí)比較乏力。數字PCR的靈敏度為0.01%，甚至0.001%，對于千分之幾級別的低頻突變不僅可以檢測到，而且能夠精確定量。

在“精準醫療”風(fēng)行的今天，微創(chuàng )或無(wú)創(chuàng )的“液態(tài)活檢”也漸漸替代了“組織活檢”，占了上風(fēng)。實(shí)際上，常用的體液樣本（如血液、胸腹水、尿液等）中游離DNA（cfDNA）很少，而ctDNA更少，只占約1%。如此微量的核酸，NGS靈敏度不足以精確檢測，而數字PCR卻可以通過(guò)微液滴處理，在每個(gè)微液滴中有效減少正常體細胞DNA的干擾，檢測到痕量ctDNA。

2. CNV檢測
除了SNV之外，異常的拷貝數變異（CNV）也是許多人類(lèi)疾?。ㄈ绨┌Y、遺傳病、心血管疾?。┌l(fā)生的重要分子機制。數字PCR的“微分”技術(shù)，擺脫對Ct值的依賴(lài)，直接獲取靶基因的絕對拷貝數，其檢測精度遠超二代測序、芯片雜交等技術(shù)平臺。因此，數字PCR技術(shù)可以對NGS、aCGH的實(shí)驗結果進(jìn)行有效驗證，作為其真實(shí)性的二次確認。同時(shí)，CN評估的主要技術(shù)瓶頸是如何在統計置信度下有效區分連續的CN。隨著(zhù)CV增加，目標遺傳物質(zhì)之間的差異百分比下降，使得CNV的檢測更加困難。數字PCR系統通過(guò)在上萬(wàn)個(gè)微液滴中進(jìn)行CNV特定片段的擴增反應，能實(shí)現對高連續拷貝數（例如5 vs 6, 甚至10 vs 11）的區分。

3.  基因融合檢測
非小細胞肺癌患者中，一小部分會(huì )檢測到ALK融合；不吸煙的肺腺癌患者中，ROS1融合則比較多見(jiàn)。臨床上檢測基因融合，一般使用免疫組化（IHC）、熒光原位雜交（FISH）和逆轉錄RT-PCR的方法。IHC簡(jiǎn)便易行，但靈敏度低，假陰性高，陽(yáng)性判讀標準因人而異。FISH作為檢測的金標準，靈敏度和特異性高，但仍有較高的假陰性概率；不僅耗時(shí)長(cháng)，對操作和判讀的要求也很高。RT-PCR具有快速簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，但因樣本降解或污染也存在一定的假陽(yáng)性和假陰性。數字PCR的高靈敏度、高準確度特點(diǎn)，加之對干擾的耐受力，可實(shí)現融合基因的精確定量。

4. CRISPR
“基因編輯”的概念隨著(zhù)CRISPR-Cas9技術(shù)受熱捧而被大眾熟知，最近更是因為“首例免疫艾滋病的基因編輯嬰兒”而變得熾手可熱。但CRISPR-Cas9技術(shù)尚未達到百分百的成功率，基因編輯常常存在不可預期的“脫靶”效應。如何驗證基因編輯的成功性，NGS在靈敏度上力有未逮，而數字PCR技術(shù)則可以大顯身手。據悉，Broad研究所張鋒團隊發(fā)明了以CRISPR為基礎的SHERLOCK技術(shù)，能夠對核酸進(jìn)行高靈敏度的定性檢測，但對基因編輯效率精確定量評估時(shí)仍采用了數字PCR技術(shù)。

5. NGS驗證和文庫定量
NGS測序公司通常使用Qubit或熒光qPCR對NGS文庫進(jìn)行定量。Qubit對異源雙鏈DNA不具有辨別力，熒光qPCR受染料的影響比較大，定量依賴(lài)擴增的效率，兩者精度都不及ddPCR。除此之外，ddPCR還能獲取樣本的定性信息，提高NGS的成功率，并對NGS的結果進(jìn)行驗證。

6. 病毒載量絕對定量
病毒載量是指單位血漿中含有的游離病毒RNA拷貝數，該指標可以提示病毒感染者所處的時(shí)期、判定疾病的進(jìn)展、監測抗病毒藥物的療效，還可觀(guān)察耐藥性問(wèn)題。普通的檢測手段如逆轉錄PCR，不能對其精確定量，或可引起對患者狀況的誤判。而利用數字PCR則可以對病毒載量進(jìn)行絕對定量，避免后續的問(wèn)題。

7. 無(wú)創(chuàng )產(chǎn)前診斷
產(chǎn)前診斷從侵入性的羊膜穿刺術(shù)、絨毛取材術(shù)到無(wú)創(chuàng )產(chǎn)前診斷（NIPT），技術(shù)的發(fā)展帶來(lái)了便利，減輕了孕婦的痛苦也避免了流產(chǎn)的發(fā)生。目前基于NGS平臺的NIPT所能檢測到的項目（13、18、21三體綜合征等），受限于平臺的低精確度。數字PCR的高靈敏度和精準度是未來(lái)應用于NIPT的良好基石。據報道，數字PCR已在脊髓性肌萎縮、血友病、鐮刀型貧血等遺傳病的無(wú)創(chuàng )產(chǎn)前診斷中顯示出了卓越的性能。

8. miRNA精確定量
miRNA是一類(lèi)長(cháng)約22nt的非編碼RNA，能夠調控基因表達、調節細胞功能，并且受到外泌體的保護而穩定地存在于外周循環(huán)中，有望成為癌癥早期檢測的生物標志物。目前血液樣品miRNA的分析測試主要依賴(lài)qPCR，但研究發(fā)現，血清或血漿中的miRNA qPCR測量結果出現了極高的差異性，因此，qPCR的方法不能作為血液miRNA的穩定檢測標準。qPCR與數字PCR的比較實(shí)驗表明，數字PCR技術(shù)不僅重復性好，準確性和可信度也更高。

9. 多重PCR
在同時(shí)檢測多種病原微生物或進(jìn)行基因分型時(shí)，通常需要設計多重PCR。目前市面上的雙色熒光數字PCR采取的策略是，通過(guò)調整熒光素濃度和兩種熒光素的配比，來(lái)進(jìn)行多達10重的PCR實(shí)驗。對于新出現的四色熒光數字PCR而言，客戶(hù)的PCR設計空間更大，結果的區分度也更佳。

總體而言，數字PCR技術(shù)放寬了對檢測樣本的要求，但并不意味著(zhù)降低了對實(shí)驗反應體系的要求。恰恰相反，數字PCR一定要使用專(zhuān)業(yè)設計的探針引物和專(zhuān)業(yè)配制的試劑體系，才能夠實(shí)現最佳的定量分析表現。

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